Mit Hilfe der in-situ-Hybridisierung lassen sich Nukleinsäuren, also DNA oder RNA, in der Zelle am histologischen Schnittpräparat (“in situ”) nachweisen. Bei der ISH werden einsträngige Nukleinsäuren, die mit einer Markierung versehen wurden, als so genannte Sonden eingesetzt. Als Sonde kann man sowohl DNA-Sonden als auch RNA-Sonden einsetzen. Wichtig ist, dass die Sonde die komplementäre Sequenz der Ziel-DNA oder -RNA aufweist. Die Sonde kann dann spezifisch an die Zielstruktur binden. Die Bindung eines Nukleinsäurestranges an einen komplementären Strang nennt man Hybridisierung. Anhand der Markierung kann dann die Sonde im Schnitt lokalisiert werden. Die Prinzipien ähneln dabei denen der Immunhistologie. Wenn die Sonde einen genügend langen Bereich auf der Zell-DNA überspannt (z.B. 100 kB), kann die Sonde auch direkt mit einem Fluoreszenz-Farbstoff gekoppelt werden. Auf eine Signalverstärkung kann dann verzichtet werden.
Die Hybridisierung wird von verschiedenen Parametern beeinflusst, die die Geschwindigkeit der Reaktion und deren Spezifität (d.h. die Frage, ob der Strang wirklich an die komplementäre Zielstruktur bindet) steuern. Bei der Hybridisierung werden diese Einflussgrößen so aufeinander abgestimmt, dass man am Ende ein möglichst kräftiges und spezifisches Signal erhält. Die Spezifität wird dabei in erster Linie durch die Höhe der Hybridisierungstemperatur gesteuert.
Die Sonden können sehr unterschiedlich markiert werden. Es gibt Verfahren, bei denen nur eine Markierung pro Sondenmolekül erfolgt. Mit anderen Markierungsreaktionen werden mehrere Label in die Sonde eingebaut. Gebräuchliche Markierungen sind
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der Einbau von Biotin- oder Digoxigenin-Gruppen
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die direkte Markierung mit Fluoreszenz-Farbstoffen oder
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der Einbau radioaktiver Nukleotide (z.B. Tritium 3H oder Schwefel-35 35S)
Die Fluoreszenz-markierten Proben können direkt im Fluoreszenz-Mikroskop nachgewiesen werden oder mit Hilfe weiterer Antikörper-Markierungen, die dann den Fluoreszenz-Farbstoff als Antigen erkennen, weiter verstärkt werden (wie in der Animation dargestellt). Die Verstärkungsreaktion kann mit einer konventionellen enzymatisch katalysierten Farbreaktion oder mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper (die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, “FISH”) abgeschlossen werden. Durch die Verwendung von unterschiedlich markierten Sonden können bei der FISH mehrere Gene gleichzeitig an einem Schnitt nachgewiesen werden. Die radioaktiven Label werden durch Autoradiografie detektiert.
