Methode der Immunhistologie

Das Prinzip der Immunhistologie besteht auf der spezifischen Erkennung von Antigenen durch Antikörper und die anschließende Verstärkung des Signals durch weitere Brückenantikörper, um schließlich das Antigen mittelbar durch eine Farbreaktion sichtbar zu machen. Es gibt eine unüberschaubare Anzahl von Antikörpern gegen unterschiedliche zelluläre Proteine, von denen aber nur ein Teil für die Diagnostik geeignet ist. Wichtig ist, dass die Stelle des Zielproteins, die vom Antikörper erkannt werden soll (das Antigen), nicht durch die Formalinfixierung zerstört oder maskiert wird. Aber selbst wenn das Antigen maskiert wird, kann man es durch eine geeignete Vorbehandlung demaskieren und wieder nachweisbar machen. Für diagnostische Fragestellungen kann und muss deshalb das Untersuchungsmaterial formalin-fixiert werden, auch wenn evtl. immunhistologische Zusatzuntersuchungen absehbar sind.

Die Antigen-Demaskierung erfolgt je nach Antikörper mit unterschiedlichen Methoden. Gebräuchliche Methoden sind:

Proteolytischer Verdau mit Trypsin, Pronase o.ä.
Kochen der Schnitte im Dampfdrucktopf, Dampfgarer, Autoklaven oder in der Mikrowelle,
nur ein Teil der in der Diagnostik verwendeten Antikörper benötigt keine Vorbehandlung.

Der primäre Antikörper wird dann in einer Lösung auf den Schnitt gegeben, die unspezifische Bindungsstellen absättigt und so ein möglichst spezifisches Signal ermöglicht. Als primäre Antikörper werden heutzutage im Wesentlichen monoklonale Antikörper verwendet. Diese werden aus Zellkulturen von immortalen Zellstämmen gewonnen und lassen so in unbeschränkter Menge gewinnen. Die Antikörper-produzierenden Zellen sind dabei Plasmazellen der Maus, die mit einer Tumorzelllinie aus Plasmazellen verschmolzen werden. Solche fusionierten Zellen nennt man Hybride. Sie vereinigen so die Produktion eines spezifischen Antikörpers mit der unbegrenzten Kulturvierbarkeit einer Tumorzelllinie. Für dieses Verfahren erhielten übrigens Georges Franz Köhler und Cesar Milstein 1994 den Medizin-Nobelpreis.

Nachdem der primäre Antikörper an das Antigen im Schnitt gebunden ist, wird er mit einem Sekundärantikörper markiert. Der Sekundärantikörper ist gegen Immunglobuline von Mäusen oder Kaninchen gerichtet und kann so für verschiedene Primärantikörper verwendet werden. Je nach Nachweisverfahren kann der Sekundärantikörper chemisch modifiziert sein. Typische Verfahren sind:

die ABC-(Avidin-Biotin-Komplex-) Methode und andere Biotin-basierte Methoden
die APAAP-(alkalische Phosphatase-anti-alkalische-Phosphatase-) Methode
Fluoreszenz-Methoden und
Polymer-gekoppelte Nachweisverfahren (z.B. EnVision, Novolink etc.)

Die beiden ersten Methoden sind enzymatische Methoden, bei denen das Antigen durch eine Farbreaktion dargestellt wird. Bei den Fluoreszenz-Methoden ist ein Fluoreszenz-Farbstoff an den Sekundärantikörper gekoppelt, so dass dieser mit einem Fluoreszenz-Mikroskop nachweisbar ist.

Bei der ABC-Methode wird die ausgesprochen starke Bindung zwischen Biotin und Streptavidin ausgenutzt. Biotin ist ein kleines Molekül, das dem Vitamin B entspricht. Streptavidin ist ein kleines Protein, das vier Bindungsstellen für Biotin besitzt, von denen aber nur zwei besetzt werden können. Aus einem biotinylierten Enzym (Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase) und Streptavidin werden große dreidimensionale Komplexe gebildet, die über freie Bindungsstellen des Streptavidin an Biotin-Gruppen des Sekundärantikörpers binden können. So werden pro gebundenem Primärantikörper viele Enzymmoleküle am Schnitt gekoppelt.

Ein ähnliches Prinzip liegt der APAAP-Methode zu Grunde. Hier werden Komplexe aus alkalischer Phosphatase und Antikörpern gegen alkalische Phosphatase gebildet. Die Bindung an den Schnitt erfolgt über einen Brückenantikörper, der einerseits an den Sekundärantikörper bindet und mit dem anderen “Schenkel” (Fab-Anteil) den APAAP-Komplex hält.

Bei den Polymer-gekoppelten Verfahren sind der Sekundärantkörper und das Enzym gemeinsam an eine lange Dextrankette gebunden. Gegenüber den beiden o.a. chromogenen Verfahren spart man hierdurch einen Inkubations- und einen Waschschritt. Gleichzeitig ist die Sensitivität und auch die Spezifität der Färbung gesteigert.

Die Farbreaktion wird mit löslichen Substraten durchgeführt, die durch das Enzym in einen unlöslichen Farbstoff überführt wird. Der Farbstoff fällt dann sofort aus und färbt auf diese Weise das Antigen an Ort und Stelle, z.B. Im Zytoplasma, an der Zelloberfläche oder im Kern. Die Intensität der Farbreaktion ist dabei in groben Abstufungen mit der Menge des Antigens proportional.

Die Färbungen sind in den Inkubationsschritten (d.h. von der Blockierung bis zur Farbreaktion) automatisierbar. Hierdurch wird ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit der Färbungen erreicht. Wir verwenden in unserer Praxis den Autostainer der Fa. DakoCytomation.